Rev. Ciencias Veterinarias, Vol. 41, N° 1, [1-13], E-ISSN: 2215-4507, enero-junio, 2023
DOI: https://doi.org/10.15359/rcv.41-1.2
URL: http://www.revistas.una.ac.cr/index.php/veterinaria/index
Hemoparásitos en equinos de la Unidad de la Policía Montada del Ministerio de Seguridad Pública de Costa Rica
Hemoparasites in horses from the Mounted Police Unit of the Costa Rican Ministry of Public Security
Hemoparasitas em equinos da Unidade de Polícia Montada do Ministério de Segurança Pública da Costa Rica
Jéssica Arguedas Herrera1
, Antony Solórzano Morales2, Gaby Dolz2
1 Universidad Nacional, Escuela de Medicina Veterinaria, Lagunilla, Heredia, Costa Rica. jessiargue@gmail.com 
0000-0002-7973-0529
2 Universidad Nacional, Escuela de Medicina Veterinaria, Programa de Investigación en Medicina Poblacional, Lagunilla, Heredia, Costa Rica. antony.solorzano.morales@una.ac.cr 0000-0001-7774-8306, gaby.dolz.wiedner@una.ac.cr 0000-0002-9566-5130
Autora de correspondencia: jessiargue@gmail.com
Recibido: 22 de Julio, 2022 Corregido: 4 de octubre, 2022 Aceptado: 21 de octubre, 2022
Resumen
Existen hemoparásitos (protozoarios y bacterianos) intracelulares que parasitan diversas células sanguíneas. También, en forma extracelular, como el protozoario Trypanosoma evansi, el cual ocasiona enfermedades en animales y humanos. En zonas tropicales, como Costa Rica, la transmisión de hemoparásitos se favorece por la abundancia de artrópodos hematófagos que actúan como vectores biológicos (por ejemplo, las garrapatas son vectores biológicos de los protozoarios Babesia sp. y Theileria sp. y bacterias como Ehrlichia sp. y Anaplasma sp.) y vectores mecánicos (moscas y tábanos son vectores mecánicos de Anaplasma marginale y Trypanosoma evansi). El objetivo de esta investigación es determinar la presencia de parásitos sanguíneos (Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Babesia caballi, Theileria equi y Trypanosoma evansi) en los equinos de la Unidad de la Policía Montada de Costa Rica y su relación con el estado general de salud. En total, 41 equinos se sometieron a un examen clínico. Seguidamente, se tomaron muestras sanguíneas y de ectoparásitos en los equinos como en el ambiente cercano a estos. Se revisó, además, el historial clínico (padecimientos previos y resultados de hemogramas recientes). El ADN de las muestras (sangre y artrópodos) fue extraído y analizado mediante diferentes protocolos de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional o en tiempo real. Ocho (19.5%) equinos resultaron positivos a hemoparásitos, una nueva especie de Anaplasma (n=2), coinfección de esta nueva especie de Anaplasma con B. caballi (n=2), B. caballi (n=1), T. equi (n=1), especie nueva de Ehrlichia (n=1). En un equino solamente se pudo detectar la presencia de Anaplasmataceae. Stomoxys calcitrans, recolectadas cerca de los caballos, resultaron positivas a B. caballi. Tanto el grupo de equinos PCR positivos, como PCR negativos presentaron anemia, en ausencia de signos clínicos. Se recomienda secuenciar el genoma completo de los dos patógenos nuevos detectados en los caballos (Anaplasma sp. y Ehrlichia sp.) como investigar la competencia vectorial de las moscas Stomoxys calcitrans para hemoparásitos en equinos.
Palabras clave: Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Babesia caballi, Theileria equi, Stomoxys calcitrans.
Abstract
There are intracellular hemoparasites (protozoan and bacterial) that parasitize various blood cells and extracellular hemoparasites, such as protozoan Trypanosoma evansi, that cause diseases in both animals and humans. In tropical areas such as Costa Rica, the transmission of hemoparasites is favored by the abundance of hematophagous arthropods acting as biological vectors (for example, ticks are biological vectors of the protozoa Babesia sp. and Theileria sp. and bacteria such as Ehrlichia sp. and Anaplasma sp.) and mechanical vectors (flies and horseflies are mechanical vectors of Anaplasma marginale and Trypanosoma evansi). The objective of this study was to determine the presence of blood parasites (Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Babesia caballi, Theileria equi, and Trypanosoma evansi) in equines of the Costa Rican Mounted Police Unit and the relationship with their general health condition. A total of 41 equines underwent a clinical examination. Blood and ectoparasite samples were later taken from the equines as well as from their environment. The subjects’ clinical history (previous conditions and results of recent blood counts) was also reviewed. DNA was extracted and analyzed from the samples (blood and arthropods) using different protocols of the conventional or real-time polymerase chain reaction (PCR) technique. Eight (19.5%) horses were positive for hemoparasites, a new Anaplasma species (n=2), co-infection of this new Anaplasma species with B. caballi (n=2), B. caballi (n=1), T. equi (n=1), new species of Ehrlichia (n=1), and in one horse only the presence of Anaplasmataceae could be detected. Stomoxys calcitrans collected near the horses were positive for B. caballi. Both PCR positive and PCR negative horses presented anemia in the absence of clinical signs. The complete genome of the two new pathogens detected in horses (Anaplasma sp. and Ehrlichia sp.) should be sequenced, and the vectorial competence of Stomoxys calcitrans flies should be investigated for hemoparasites in horses.
Keywords: Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Babesia caballi, Theileria equi, Stomoxys calcitrans.
Resumo
Existem hemoparasitas intracelulares (protozoários e bacterianos) que parasitam diversas células sanguíneas. Também na forma extracelular, como o protozoário Trypanosoma evansi, causador de doenças em animais e humanos. Em áreas tropicais, como a Costa Rica, a transmissão de hemoparasitas é favorecida pela abundância de artrópodes hematófagos que atuam como vetores biológicos (por exemplo, carrapatos são vetores biológicos dos protozoários Babesia sp. e Theileria sp. e bactérias como Ehrlichia sp. e Anaplasma sp.) e vetores mecânicos (moscas e mutucas são vetores mecânicos de Anaplasma marginale e Trypanosoma evansi). O objetivo desta investigação é determinar a presença de parasitas sanguíneos (Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Babesia caballi, Theileria equi y Trypanosoma evansi) nos equinos da Unidade da Policía Montada da Costa Rica e sua relação com o estado geral de saúde. No total, 41 equinos foram submetidos a exame clínico. Em seguida, foram coletadas amostras de sangue e ectoparasitas dos cavalos, bem como do ambiente próximo a eles. A história clínica (condições prévias e resultados recentes de hemograma) também foi revisada. O DNA das amostras (sangue e artrópodes) foi extraído e analisado por diferentes protocolos da técnica convencional ou reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Oito (19,5%) cavalos foram positivos para hemoparasitas, uma nova espécie de Anaplasma (n=2), coinfecção desta nova espécie de Anaplasma com B. caballi (n=2), B. caballi (n=1), T. equi ( n=1), novas espécies de Ehrlichia (n=1). Em um cavalo foi detectada apenas a presença de Anaplasmataceae. Stomoxys calcitrans, coletado próximo aos cavalos, foi positivo para B. caballi. Tanto o grupo de cavalos positivos quanto PCR negativos apresentaram anemia, na ausência de sinais clínicos. Recomenda-se sequenciar o genoma completo dos dois novos patógenos detectados em equinos (Anaplasma sp. e Ehrlichia sp.), bem como investigar a competição vetorial de moscas Stomoxys calcitrans por hemoparasitas em equinos.
Palavras-chave: Anaplasma sp., Ehrlichia sp., Babesia caballi, Theileria equi, Stomoxys calcitrans.
Introducción
Los hemoparásitos abarcan distintos grupos de microorganismos como protozoarios y bacterias, que parasitan células sanguíneas. También pueden encontrarse en forma extracelular, como el protozoario Trypanosoma evansi; capaz de causar enfermedades tanto en animales como en humanos. Se transmiten por medio de vectores mecánicos y vectores biológicos. Los principales signos clínicos son: fiebre, inapetencia, ictericia, edemas, hemorragias, trombocitopenia y anemia (Bowman, 2011; Rodríguez et al., 2000). En zonas tropicales, como Costa Rica, la transmisión de hemoparásitos se favorece por la abundancia de artrópodos hematófagos que actúan como vectores biológicos o mecánicos. Existen diversas técnicas para el diagnóstico de hemoparásitos, entre ellas, el frotis sanguíneo y pruebas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), siendo esta última la que más se recomienda, dado que es altamente sensible y específica (Foley, 2020; Thirumalapura and Walker, 2014). Los principales hemoparásitos, reportados en equinos en el país, son Theileria equi y Babesia caballi, causantes de la piroplasmosis equina, la cual se considera endémica en Costa Rica, reportándose seroprevalencias de B. caballi de 59% y de T. equi de 34% en equinos de rally, prevalencias de 33.3% para ambos agentes en equinos de exportación, y mayores seroprevalencias en equinos destinados a mataderos (96.1% T. equi y 78.4% B. caballi) que en equinos en cuadras (47.0% T. equi y 44.3% B. caballi). En equinos de zonas indígenas se han reportado seroprevalencias de 69.2% para B. caballi y 88.5% para T. equi, y mediante PCR se determinó la presencia de B. caballi, T. equi y ambos agentes en un 20.0%, 46.2% y 7.7% de los animales, respectivamente (Gómez, 2007; Pineda, 1998; Posada-Guzmán, et al., 2015; Vega, 2011).
Con respecto a Anaplasma phagocytophilum, estudios moleculares, realizados por varios investigadores en Latinoamérica, no han logrado detectarla en la sangre de equinos (Párraga et al., 2016; Salvagni et al., 2010). Asimismo, Campos (2015), en Costa Rica, tampoco logró determinar la presencia de A. phagocytophilum en sangre de 300 equinos de distintas zonas del país, utilizando un PCR anidado. Por su parte, recientemente, Arguedas-Herrera et al. (2019) reportaron una posible nueva especie de Ehrlichia en equinos de Costa Rica (Arguedas-Herrera et al., 2019), mientras que, a la fecha, no se ha investigado la presencia de Trypanosoma evansi en equinos de nuestro país. Sin embargo, se han presentado casos de enfermedad y muerte en equinos, que hacen sospechar, a los veterinarios, que consultan el laboratorio, de la presencia de un hemoparásito. Por consiguiente, el objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de parásitos sanguíneos (Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Babesia caballi, Theileria equi y Trypanosoma evansi) en equinos de la Unidad de la Policía Montada de Costa Rica y relacionar la presencia de los patógenos con el estado general de salud de los animales.
Materiales y métodos
Tipo de estudio y población por estudiar
Se realizó un estudio transversal, descriptivo, cuyo propósito fue la detección molecular de hemoparásitos, específicamente: Anaplasma spp. Ehrlichia spp., Babesia caballi, Theileria equi y Trypanosoma evansi en los equinos de la Unidad de la Policía Montada del Ministerio de Seguridad Pública de Costa Rica. Se analizó 41 equinos de la Unidad de la Policía, los cuales trabajaron en diversas regiones y en algunas ocasiones, en condiciones adversas.
Toma de muestras de sangre, ectoparásitos e información general
Mediante una ficha clínica, se recopiló la información general de los animales (identificación, edad, sexo, raza y color, lugar de trabajo, historial clínico, presencia de ectoparásitos, y los resultados de los hemogramas y químicas clínicas recientes). Seguidamente, se realizó un examen clínico a cada equino. Finalmente, se procedió a tomar las muestras de sangre, las cuales se transportaron a 4°C hasta el laboratorio, en donde se congelaron a -20°C hasta su procesamiento.
Los valores de los parámetros de los exámenes hematológicos y de químicas sanguíneas, suministrados por la Unidad de la Policía Montada, se analizaron según Meneses y Bouza (2015). Se utilizó el valor del hematocrito como indicador de anemia. Los artrópodos que se recolectaron, tanto sobre los equinos como en el ambiente cercano a estos, se almacenaron en alcohol al 70% y se transportaron a temperatura ambiente hasta el laboratorio, donde se identificaron mediante las llaves taxonómicas descritas por Mullen y Durden (2002).
Análisis molecular (reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación) y análisis filogenéticos
Las muestras sanguíneas se sometieron a extracción de ADN, mediante el ensayo Dneasy® Blood and Tissue (QIAGEN), siguiendo los pasos recomendados por el fabricante. Se congelaron a -20°C hasta su análisis. Individuos de artrópodos de la misma especie se juntaron en un grupo. Se extrajo el ADN con el ensayo descrito arriba y se congelaron a -20°C hasta su análisis. Se analizaron todas las muestras mediante distintos protocolos de PCR. En el Cuadro 1 se muestran los diferentes protocolos de PCR utilizados en el análisis de las muestras, los genes de los diferentes patógenos amplificados y las referencias de los protocolos.
Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% en Tris-Borato-EDTA (TBE), teñidos con fluorocromo GelRed DNA Stain (Biotium®). Seguidamente, fueron enviados a la compañía Macrogen en Seoul, Corea del Sur, para su purificación y secuenciación. Las secuencias obtenidas fueron editadas con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor® (Hall, 1999) y alineadas con el programa Clustar Omega. Además, fueron comparadas con las secuencias disponibles en la base de datos de GenBank mediante la utilización del programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico descriptivo para caracterizar las muestras positivas de la población muestreada.
Resultados
Un 56% de los animales eran machos y un 44% hembras. La mayoría, (73%), estaban en el grupo etario de 5-18 años, mientras que un 25% tenía más de 18 años. Las razas predominantes fueron Cuarto de Milla (17%) y Criollo (15%), mientras que un 44% fueron cruces, 17% sin raza definida, 5% Español y 2% Azteca.
El examen, objetivo general, determinó una buena condición corporal y de pelaje, estado sensorio alerta, temperatura rectal y llenado capilar dentro del rango en el 100% de los animales. Solamente cuatro animales (9.7%) mostraron mucosas pálidas; a pesar de ello, en ningún animal se determinó signo clínico alguno. Tampoco se encontró garrapatas, pero se determinó presencia de moscas, sobre y en los alrededores de los caballos. Todos los caballos habían sido desparasitados en los últimos tres meses y ninguno había sido diagnosticado con hemoparásitos en el pasado. En ocho (19.5%) equinos se detectó la presencia de hemoparásitos en la sangre, dos caballos mostraron coinfección. De estos ocho animales, seis caballos resultaron positivos para Anaplasmataceae, con la presencia de Anaplasma sp. (n=4), Ehrlichia sp. (n=1) y en un caballo no se pudo determinar la especie de Anaplasmataceae. En tres caballos se detectó la presencia de B. caballi y en uno T. equi. La coinfección de los dos caballos fue con B. caballi y Anaplasma spp. y B. caballi y Anaplasmataceae. No se pudo determinar la presencia de especies de Trypanosoma en los animales analizados. En el Cuadro 2, se detalla los resultados obtenidos en los distintos PCR realizados.
El análisis de los valores hematológicos de los equinos PCR positivos mostró una media en hematocrito y hemoglobina por debajo de los valores referenciales para la especie. Sin embargo, mediante la prueba de t-student no se determinó diferencias significativas entre los valores hematológicos de animales PCR negativos y PCR positivos. Las características de los equinos PCR positivos, los hallazgos del examen objetivo y los valores hematológicos, se muestran en el Cuadro 3. Se determinó mucosas pálidas (37.5%), bajos valores de hematocritos (75%), hemoglobina (50%) e hipoglicemia (25%).
Se recolectó un total de 15 moscas de establo (Stomoxys calcitrans), las cuales se analizaron en un grupo y se determinó la presencia de Babesia caballi y negativos para los demás agentes.
Se logró secuenciar dos (PM16 y PM19) de cuatro muestras positivas a Anaplasma spp. (gen ARNr 16S). La secuenciación de las dos muestras positivas mostró una similitud del 98% (758pb/774pb y 739pb/753pb, respectivamente) con la secuencia MW019845 de Anaplasma spp. aislada de bovinos en Kenia, mientras que la secuenciación de una muestra equina (PM 31) y de las moscas mostraron una similitud del 98% (435 pb/446 pb) y 100% (446 pb/446 pb), respectivamente, con la secuencia de B. caballi MG948456 aislada en un equino en Java Occidental, Indonesia.
Discusión
Del total de equinos analizados se determinó una media de hematocrito y hemoglobina por debajo de los rangos normales, indicando que algunos animales estaban con anemia, lo cual podría ser consecuencia de la presencia de algún agente infeccioso (Marks, 2019; Van der Kolk and Veldhuis, 2013). No obstante, solamente un 19.5 % de los equinos mostró presencia de hemoparásitos y ningún animal el virus de la anemia infecciosa equina (resultados no mostrados).
Otras causas de anemia, en una población equina, pueden deberse a disminución en el consumo de alimento, deficiencias nutricionales de vitaminas y minerales o por consumo deficiente de proteína y energía (Diaz et al., 2018; Marks, 2019; Van der Kolk and Veldhuis, 2013). En este caso, los animales se encontraban en pastoreo libre, siendo el forraje la principal fuente de alimentación, por lo cual, los equinos pueden haber sufrido eventualmente deficiencias nutricionales, por una calidad insuficiente del pasto en cuanto a aportes proteicos, energéticos, de vitaminas y minerales (Sharpe, 2018; Waran, 2007).
El porcentaje de animales, detectados con hemoparásitos (19.5%), fue similar a lo reportado en el Noroeste de Colombia, utilizando PCR (Agudelo et al., 2017), mientras que, en otros estudios, realizados en Latinoamérica, se ha reportado mayor cantidad de animales infectados con parásitos sanguíneos, utilizando frotis sanguíneo como técnica diagnóstica (Castellanos et al., 2010; Ramírez, 2007).
El hemoparásito, que más frecuentemente se detectó, en esta investigación, fue una especie de Anaplasma. Sin embargo, se descartó que se tratara de Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, Anaplasma platys like, Anaplasma marginale, Anaplasma ovis o Anaplasma centrale. Estos hallazgos concuerdan con un estudio realizado por Campos (2015) en Costa Rica, en el cual no se logró determinar la presencia de A. phagocytophilum, en una muestra de 300 equinos de distintas zonas del país. Así mismo, concuerda con estudios realizados en Nicaragua, Brasil y Venezuela, en los cuales tampoco se identificó A. phagocytophilum en equinos (O’ Nion et al., 2015; Párraga et al., 2016; Salvagni et al., 2010). Las secuencias de los segmentos del gen ARNr 16S, de las dos muestras positivas a Anaplasma sp. no se lograron alinear con ninguna especie de Anaplasma depositada en GenBank, lo cual sugiere que se trate de una posible nueva especie de Anaplasma, que no fue posible detectar con los iniciadores utilizados (Dugat et al., 2015). Para confirmar el hallazgo de una nueva especie de Anaplasma en equinos, se recomienda secuenciar el genoma completo de este patógeno detectado (Dugat et al., 2015).
Mediante amplificación de un segmento del gen groEL de Ehrlichia spp. se detectó una nueva especie, reportada previamente, en otro equino de Costa Rica (Arguedas et al., 2019). En este caso, también, se descartó la presencia de Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis y Ehrlichia ewingii, por lo cual se sospecha de que se trate también de una especie no descrita antes en equinos en el país, lo que concuerda con reportes de México, Nicaragua y Brasil que sugieren la presencia de nuevas especies de Ehrlichia en equinos (O’Nion et al., 2015; Vieira et al., 2016).
Solamente en tres equinos se encontró la presencia de B. caballi y en un equino T. equi, que concuerda con otros estudios que sugieren un mayor rango de infección de B. caballi (Pineda, 1998; Rosales et al., 2016), aunque también se han reportado infecciones mayores con T. equi (Heim et al., 2007; Jiménez et al., 2014; Posada-Guzmán et al. 2015; Vega, 2011).
Seis de ocho equinos PCR positivos presentaron alteraciones hematológicas, pero ausencia de signos clínicos, sugiriendo que cursaban infecciones subclínicas. La anemia y trombocitopenia determinada, coincide con hallazgos anteriores en equinos con piroplasmosis en Cuba (Diaz et al., 2018), y en un estudio de hemoparásitos (Anaplasma phagocytophilum, Trypanosoma evansi y Babesia equi) en Venezuela (Castellanos et al., 2010), mientras que la hipoglicemia se podría relacionar con una disminución de ingesta de alimentos o mayor utilización de glucosa (Reed et al., 2018; Van der Kolk and Veldhuis 2013). El hallazgo hematológico más importante de los cuatro equinos, PCR positivos a Anaplasma spp., fue la anemia. En la literatura se reporta trombocitopenia como el principal hallazgo de infecciones por A. phagocytophilum (Dzięgiel et al., 2013). Sin embargo, solamente uno de los cuatro equinos presentó trombocitopenia. Los hallazgos hematológicos determinados en el presente estudio pueden deberse a que la especie de Anaplasma, encontrada en nuestros equinos, no parece ser A. phagocytophilum, especie que sí parece producir trombocitopenia en el 100% de equinos infectados (Frazén et al., 2005; Frazén et al., 2009). El equino PCR positivo a Ehrlichia spp. no mostró alteraciones hematológicas, lo cual difiere con otros estudios, que reportan la anemia como el hallazgo hematológico principal, esto puede deberse a que se tratara de una infección subclínica o que estuviera en el período de incubación de la enfermedad (Muraro et al., 2021; Rivera and Motta, 2013). Finalmente, dos de los tres equinos positivos a B. caballi presentaron anemia e hipoglicemia, mientras que el equino positivo a T. equi presentó anemia, lo cual concuerda con el estudio de Díaz y colaboradores (2018) en Cuba, que reportan, como hallazgo más importante, en infecciones con estos dos agentes, la anemia; además, hay estudios que relacionan la hipoglicemia con babesiosis (Díaz et al., 2018; Naji, 2019).
El grupo de moscas analizado resultó positivo a Babesia caballi, siendo éste el primer reporte de ADN de este agente en moscas del establo en Costa Rica y a nivel mundial. En esta especie de moscas, investigadores de España y Hungría reportaron, recientemente, la presencia de ADN de Theileria equi (Rodríguez et al., 2014) y de Theileria orientalis, Theileria equi y Theileria capreoli (Hornok et al., 2020), respectivamente. Sin embargo, tanto B. caballi como T. equi son protozoarios transmitidos por garrapatas, en las cuales se desarrollan cumpliendo un ciclo complejo de reproducción sexual (gametogonia) y asexual (esquizogonia), lo que prueba la competencia vectorial de esos artrópodos, por lo cual es poco probable que las moscas Stomoxys calcitrans puedan actuar como vectores de estos hemoparásitos. Mientras se ha evidenciado a esta mosca de establo como vector mecánico de Anaplasma marginale en bovinos (Baldacchino et al., 2013; Scoles et al., 2005), se requiere más estudios para poder determinar su competencia vectorial para hemoparásitos (Díaz- Sánchez et al., 2020; Gumm and Pitt; 2012; Meléndez, 2000; Wise et al., 2013).
Conclusiones
En la presente investigación se reporta la presencia de nuevas especies de Anaplasma y Ehrlichia en equinos de la Policía Montada de Costa Rica. También la presencia de ADN de B. caballi en moscas S. calcitrans recolectadas sobre los equinos y en el ambiente cercano a estos.
Se recomienda secuenciar el genoma completo de estos dos patógenos, detectados en los caballos, para caracterizar estas especies e investigar competencia vectorial de las moscas Stomoxys calcitrans como vectores mecánicos o biológicos de hemoparásitos en equinos.
Agradecimientos
Al doctor Francisco Madrigal Villa y personal de la Unidad de la Policía Montada por apoyar este estudio. A la doctora Ana Jiménez Rocha por la ayuda brindada en esta investigación.
Conflicto de Intereses
Los autores declaramos que no poseemos conflicto de intereses con los temas expuestos.
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